蛋白质组学研究已经走出单纯以规模化鉴定为目的的早起阶段，差异定量蛋白质组学成为最主要的研究领域之一。DIGE、SILAC、ITRAQ 等稳定同位素标记定量技术经过若干年的应用之后，其局限性和缺陷逐步暴露。

Label-free 样本无需标记，直接采用液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，通过比较质谱信号强度（以肽段的色谱峰积分面积为基础，通过比较不同样品中对应蛋白酶解后多肽的色谱峰面积来相对定量）和谱图计数（以肽段被质谱检测到的次数即肽段二级图谱匹配数），来分析不同来源样本蛋白量的变化。与标记定量技术相比，其技术优势就在于蛋白质不需要昂贵的同位素标签进行标记，所需样品总量少，且不受样品数量的限制。随着质谱以及定量算法和定量软件的发展，Label free 定量方法越来越成熟，并得到了广泛的应用。

目前蛋白质组深度覆盖领域常用的是通过结合长柱子和长梯度的方式来达到蛋白质组的深度覆盖目的，但这同时也导致了整个质谱鉴定周期延长，最终影响了定量的准确性。为同时达到蛋白质组的深度覆盖与精确定量，结合 Label free 定量技术，我们发展了蛋白质组快速深度覆盖技术。利用一维高 pH 的色谱分离结合二维的低 pH 的 HPLC 形成良好的肽段水平正交分离来充分降低蛋白样品的复杂程度，从而实现在 12 小时内完成一个蛋白组的深度覆盖。

配套设备：

赛默飞 Q Exactive 系统

赛默飞 Q Exactive Plus 系统

赛默飞 Q Exactive HF 系统




赛默飞 Orbitrap Fusion 三合一质谱仪

主要应用：

1. 动植物组织或细胞、微生物、体液的蛋白组鉴定和相对定量；2.Pull-down 方法或免疫沉淀方法富集的蛋白鉴定和相对定量；3. 翻译后修饰肽段富集后定量分析。

主要特点：

1. 所需样本量少，可对微量样本进行分析，不受样本数量限制；

2. 深度覆盖检测动态范围可以达到 8 个数量级以上，提高了低丰度蛋白质的检测效率；3. 可重复性高。

实验流程：

1.细胞或组织样品蛋白的抽提。

2.蛋白经过还原烷基化后，胰蛋白酶消化；如需蛋白质组深度覆盖可选 sRP 肽段水平预分离。



3.酶切产物由高精度质谱分析，产出数据由 Mascot 等定量软件进行分析。

可选数据分析

1. 数据产出统计；

2. 蛋白质鉴定及定量结果；

3. 蛋白质 GO 分析及差异蛋白 GO 分析；

4. 蛋白质 Pathway 通路分析及差异蛋白的 Pathway 通路分析；5. 重复性分析（仅针对有重复设计的项目）；

6. 多样品间表达模式聚类分析（适用于样本数≥3 的项目）。

样品要求

蛋白提取物：≥50 μg

细胞：≥106

组织：动物组织≥1 mg, 植物组织≥10 mg

体液：血清≥5μL,脑脊液≥10μL

参考文献

1、Zhu W, J.W. Smith, and C.M. Huang. Mass spectrometry-based label-free quantitative proteomics.J BIOMED BIOTECHNOL. 2010; 2010: p. 840518.

2、Ding C, Jiang J, Wei J, et al. A fast workflow for identification and quantification of proteomes,Mol Cell Proteomics. 2013 Aug;12（8）：2370-80.

3、Niemann M, Wiese S, et al. Mitochondrial outer membrane proteome of Trypanosomabrucei reveals novel factors required to maintain mitochondrial morphology. Mol Cell Proteomics. 2013; 12（2）： 515-28.

4、Vanderschuren H, Nyaboga E, et al. Large-Scale 2、Cholewa BD, Pellitteri-Hahn MC, et al. Large-Scale Label-Free Comparative Proteomics Analysis of Polo-Like Kinase 1 Inhibition via the Small-Molecule Inhibitor BI 6727 （Volasertib） in BRAFV600E Mutant Melanoma Cells. J Proteome Res. 2014 Jun 9.

5、Proteomics of the Cassava Storage Root and Identification of a Target Gene to Reduce Postharvest Deterioration. Plant Cell. 2014.

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